载体构建种类常见的传统载体构建系统

导读基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法。即载体构建，构建的实验通俗点来说就是”切、接、转、增、检”，切目的片段和载体，将正确的片段和载体连接，做转化，扩....

基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法。即载体构建，构建的实验通俗点来说就是”切、接、转、增、检”，切目的片段和载体，将正确的片段和载体连接，做转化，扩大培养增加构建好的载体数，送测序进行检测；在具体的实验中因为构建的方法不一样会有很多的细节发生变化，现下用的较多的就是双酶切和同源重组的方法。通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法，这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。

一、目的基因的扩增首先用软件设计目的基因的引物，引物中需要加入酶切位点及保护性碱基，在NCBI上BLAST保证引物的特异性，以及需要注意引物的Tm值、GC含量等等；然后从样本中扩增出我们需要的目的基因的条带，需要用到PCR酶，样本来源可以是基因组DNA也可以是cDNA等，根据构建的载体的不同选择，例如干扰载体、过表达载体、基因编辑载体，启动子分析载体等等；后面将PCR产物跑胶，看产物是否是特异的条带，只需将正确的条带切胶进行胶回收即可，或者取5ul的产物跑胶确认特异性条带后直接将剩下的产物进行胶回收就可以得到目的基因的条带了。

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