聚乙二醇刺激细胞融合的原理，聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的应用进展

导读来源：国际呼吸杂志2020年第16期作者：贺晶晶高俊珍内蒙古医科大学附属医院呼吸内科，呼和浩特010000通信作者：高俊珍Email：nmgJunzheng....

来源：国际呼吸杂志2020年第16期

作者：贺晶晶 高俊珍

内蒙古医科大学附属医院呼吸内科，呼和浩特 010000

通信作者：高俊珍

Email：nmgJunzhengao@163.com

摘要

化疗在晚期肺癌的治疗占有不可替代的地位，但恶性肿瘤化疗后骨髓抑制发生率高，粒细胞减少症是化疗最严重的血液学毒性反应，会影响化疗方案的正常进行，降低缓解率。聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子可用于预防及治疗粒细胞减少症，它是由重组人粒细胞集落刺激因子和单甲氧聚乙二醇共价结合后生成，其使用便利性、不良事件均优于重组人粒细胞集落刺激因子，但是存在应用时间短、应用经验不足、应用指征把握不准确等问题。本文系统阐述聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子的作用机制及应用进展。

肺癌是目前我国发生率增长最快的恶性肿瘤，短短30年，肺癌由我国癌症死因回顾调查第5位跃居首位，是当今威胁人类健康的最严重的肿瘤之一。据相关研究统计，大约75%～80%的患者在诊断明确时已发展为晚期肺癌[1,2]，失去手术治疗机会，而化疗在晚期肺癌的治疗占有不可替代的地位。恶性肿瘤化疗后骨髓抑制发生率高达50%～91.3%，Ⅲ、Ⅳ度骨髓抑制相关性死亡率最高达12%。其中粒细胞减少症是化疗最严重的血液学毒性反应，90年代以前化疗引起的粒细胞减少症主要靠输血及口服一些升白细胞的中西药，如：利可君、鲨肝醇、地榆升白片、维生素B4等，但疗效不佳；所以重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)应运而生，1991年上市成为首个可治疗粒细胞减少的药物，但其半衰期短、需反复注射，后根据市场需求研制出可用于预防粒细胞减少的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(pegylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，PEG-rhG-CSF)。本文主要对PEG-rhG-CSF合成、作用机制及临床应用进行介绍。

1 粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的发现及作用机制

人体内本身存在内源性G-CSF，它是一种大小为19 600的酸性糖蛋白，由人体的巨噬细胞、纤维母细胞和内皮细胞分泌产生[3]。G-CSF属于Ⅱ类造血生长因子，有细胞系特异性，无种族特异性，仅作用于中性粒细胞及其祖细胞[4]。而且是控制髓系祖细胞增殖和分化为中性粒细胞的主要生长因子[5]。科学家们从基础到临床，从动物到人类，历经50余年才得以让世人揭开它的神秘面纱，后来应用重组技术批量生产，为人类解决了恶性肿瘤化疗后粒细胞减少的大问题。

1935年Pluzniek和Sachs[6]报道，在琼质培养基上进行小鼠骨髓干细胞培养时，底层放入肾细胞和胎儿细胞，可见到粒细胞集落和巨噬细胞集落的形成。由此推测，底层细胞可能分泌一种特异的活性物质，刺激粒细胞和巨噬细胞集落的形成。1966年Ichikawa等[7]分别在小鼠骨髓细胞和脾细胞集落培养过程中发现，粒细胞、巨噬细胞只有在含有"滋养"细胞或组织的条件培养基中才能分裂、增殖，形成集落。依照促红细胞生长素的模式，他们推测在条件培养基中含有一种刺激粒-巨噬系细胞增殖的调节因子，并首次提出"集落刺激因子"的概念。

1977年Stanley和Heard[8]从小鼠纤维母细胞培养液中分离到功能相似的集落刺激因子。至1983年，各实验小组通过分离、纯化，得到4种鼠类集落刺激因子，即G-CSF、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞细胞集落刺激因子和IL-3。在鉴定鼠G-CSF后，发现了具有类似活性的人类分子，通过研究其受体结合以及生物学作用，发现这种人类分子，与先前在人胎盘条件培养基中鉴定的具有造血活性的刺激因子相同[9]。鼠和人G-CSF分子的增殖和分化诱导活性与物种边界交叉，后者以物种特异性方式对嗜中性粒细胞谱系具有活性。

1975年Stanley等[10]首次成功地从人尿中分离到一种刺激巨噬细胞集落形成的集落刺激因子。Welte等[11]于1985年成功地从人膀胱癌细胞系5637的低血清(0.2%胎牛血清)-条件培养液中纯化精制出多能造血集落刺激因子。集落刺激因子是由多种组织和肿瘤细胞系产生的调节造血的激素样糖蛋白，该蛋白也能够刺激混合菌落祖细胞(粒细胞/红细胞/巨噬细胞/巨核细胞的集落形成单位)以及早期红系祖细胞的体外生长[11,12]，经过进一步的研究，推定多系刺激活性是一种间接作用，被纯化的天然多能性分子主要活性是体外诱导中性粒细胞集落的形成[13]。

1986年Nomura等[14]建立了一种人类鳞状癌细胞系，称之为CHU-2，可产生大量的集落刺激因子，并且成功地从这些细胞的无血清条件培养液中纯化了对人和小鼠骨髓细胞都有效的粒细胞系特异性集落刺激因子。该研究最后纯化出的集落刺激因子是一种具有人类活性的粒细胞谱特异性集落刺激因子，并且报道了该人G-CSF的生化特性，包括一个独特的NH2末端氨基酸序列。同年Nagata等[15]利用Nomura纯化的G-CSF的部分氨基酸序列衍生的寡核苷酸探针克隆编码了人G-CSF的cDNA。他们证明了在细胞培养中，该cDNA被转录成具有生物活性的人G-CSF，证实了该因子的纯化源于人类集落刺激因子产生细胞系(CHU-2)，该细胞系在无血清条件培养基中可产生大量集落刺激因子活性。

大量体外实验表明，集落刺激因子主要从以下4个方面作用于造血细胞：(1)维持祖细胞和成熟血细胞在体外的存活；(2)促使非增殖期细胞进入增殖期，刺激造血细胞增殖。一般在极低浓度下即能发挥作用，其浓度不仅决定了细胞周期的长短，也决定了增殖细胞的数量；(3)诱导造血细胞的分化和成熟。该作用是部分的、有限的，仅表现在粒-巨双向潜能祖细胞，在巨噬细胞集落刺激因子或G-CSF存在条件下能以不可逆的优势形成巨噬细胞或粒细胞集落；(4)增强成熟粒细胞和单核、巨噬细胞的生物活性[16]。

G-CSF能促使粒系祖细胞的分化、增殖和成熟；促进骨髓中的造血干细胞和成熟中性粒细胞释放到外周血中[4]；可增加活性氧的生成，增强粒细胞的杀菌能力、吞噬能力以及抗体依赖性细胞杀伤力[17]；可明显加速粒细胞的恢复，缩短粒细胞缺乏的时间，减轻中性粒细胞减少的程度，降低感染的发病率。

2 rhG-CSF的生产及应用

为了批量生产应用于临床，保证体外药物的稳定性，1986年Souza等[18]报道人G-CSF基因在大肠杆菌中重组成功，表达并制备出重组蛋白。它是通过将人体G-CSF基因插入大肠杆菌的DNA后，由大肠杆菌表达产生的一种含175个氨基酸的蛋白质，有刺激粒细胞集落形成的作用。人内源性G-CSF含有糖基，在大肠杆菌中表达的G-CSF无糖基，因糖基对G-CSF的生物学活性没有明显贡献，所以其功能与内源G-CSF无明显差异[19,20]。

rhG-CSF与天然G-CSF功能相似，它与粒细胞表面特异性的受体结合，特异性刺激中性粒系祖细胞的分化和增殖，同时也增强了中性粒细胞的趋化作用，增加了过氧化物的产生[21]。国外2项动物实验[22,23]表明：rhG-CSF在体内引起的造血增生作用与体外实验结果相似。每日注射1～3次rhG-CSF，通常可致外周血和组织中粒细胞、巨噬细胞数量增高10～100倍，且随着反复注射而得以维持。

rhG-CSF在接受小细胞肺癌强化化疗的患者中的Ⅰ/Ⅱ期临床研究开始于1987年[24]，重组人G-CSF体现出良好的耐受性，明显减少因强化化疗方案引起的粒细胞减少症和重症感染。起初研究发现应用rhG-CSF后，中性粒细胞计数先迅速出现短暂的减少，之后很快则呈剂量依赖性的持续升高。Ⅲ期临床试验证实，预防性应用rhG-CSF与安慰剂相比，可以使中性粒细胞减少性发热(febrile neutropenia，FN)的发生率、感染的发生率下降约50%，Ⅳ度中性粒细胞减少的发生率从89%降低至56%，平均持续时间减半，静脉应用抗生素治疗时间与住院日分别缩短47%和45%[25]。

非格司亭(NeupogenTM)在1991年作为第一个rhG-CSF被美国食品药品监督管理局批准上市，之后被70多个国家批准用于治疗骨髓移植后的骨髓抑制、严重的慢性中性粒细胞减少症、急性白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征以及动员外周血祖细胞进行移植。非格司亭的使用使全剂量化疗和大剂量化疗成为可能，并使免疫受损的患者受益。第二种形式的非格司亭，名为来格司亭(GranocyteTM)，由中华仓鼠卵巢细胞表达产生的一种含174个氨基酸序列的rhG-CSF，1993年在欧洲被批准临床应用；研究表明非格司亭与来格司亭的生化特性相近，来格司亭具有糖基化，这是两者的主要区别[26]。1993年中国药政主管部门先后批准日本生产的非格司亭和来格司亭上市，主要用于治疗和预防肿瘤化疗后引起的中性粒细胞减少症[27,28]。

紧随其后，我国开始自主研制rhG-CSF，我国食品药品监督管理局最终在1996年批准了我国第一个rhG-CSF(商品名：吉粒芬)上市，由杭州九源基因工程有限公司生产，历经20多年应用发展，到目前为止，临床上应用的国产rhG-CSF有13种。

继1991年之后，rhG-CSF被广泛、迅速应用于临床。国内外多项基于循证医学的荟萃分析结果表明，使用rhG-CSF后Ⅳ度粒细胞减少的持续时间、患者的住院时长明显缩短[29]，与FN相关不良事件发生减少以及感染相关死亡率的明显降低[26,30]。随后很快被写入美国、欧洲、加拿大等国家权威学术机构的指南，2011年欧洲癌症研究与治疗组织(European Organisation for Research and Treatment of Cancer，EORTC)推荐：65岁以上老年人，原发肿瘤控制不佳，存在超过10 d的中性粒细胞减少[绝对中性粒细胞计数(absolute neutrophil count，ANC)<0.1×10